Konplèks replikasyon-transkripsyon Coronavirus: NMPylation enpòtan ak selektif nan subinite NiRAN-RdRp nan sit konsève nan nsp9

Edited by Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, apwouve nan dat 25 desanm 2020 (revize nan dat 25 oktòb 2020)

Nou rapòte entèraksyon ki genyen ant subinite nan replikasyon konplèks koronaviris-transkripsyon, ki esansyèl pou replikasyon ak konsèvasyon evolisyonè.Nou bay prèv ki montre domèn NiRAN ki asosye ak nsp12 gen aktivite transferaz nukleozid monofosfat (NMP) nan trans, epi nou idantifye nsp9 (yon pwoteyin obligatwa RNA) kòm sib li.NiRAN katalize atachman kovalan nan pati NMP a nan tèminal amino nsp9 konsève nan yon reyaksyon ki depann sou iyon Mn2 + ak adjasan rezidi Asn konsève.Yo te jwenn ke aktivite NiRAN ak nsp9 NMPylation yo esansyèl pou replikasyon coronavirus.Done yo pèmèt nou konekte aktivite sa a nan makè anzim viris enbrike la ak obsèvasyon anvan yo nan ipotèz ke inisyasyon sentèz RNA nan yon klas viris RNA se fonksyonèl ak evolisyonè ki konsistan.

RNA-depandan RNA polymerase (RdRps) nan Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, ak 12 lòt fanmi) se lye ak domèn amino-tèminal (N-tèminal) nan pwoteyin ki pa estriktirèl (nsp) ki soti nan poliprotein nan, ki rele NiRAN. 1ab konpoze de proteaz prensipal viral (Mpro).Précédemment, viris atè NiRAN-RdRp nsp pwòp aktivite GMPylation/UMPylation yo te rapòte, epi li te sijere pou jenere yon pasajè pou transfè monofosfat nukleozid (NMP) nan viris (aktyèlman enkoni) ak / oswa selil biopolymerization Bagay yo.Isit la, nou montre ke kowonaviris la (Kowonaviris Imèn [HCoV]-229E ak Sendwòm Respiratwa Aigu Grav Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) gen aktivite NMPylation Mn2+ ki depandan, ki sòti nan nsp9 atravè fòmasyon nsp9 Mpro-medyatè Apre N-tèminal flanke nsps la proteolitik lage, fosforamidat la kole ak amine prensipal la (N3825) nan N-tèminal nsp9 la.Uridine trifosfat se nukleotid pi pito nan reyaksyon sa a, men adenozin trifosfat, guanozin trifosfat, ak cytidine trifosfat yo tou apwopriye ko-substra.Etid mitasyon ki itilize pwoteyin recombinant coronavirus nsp9 ak nsp12 ak mutan HCoV-229E jenetikman te detèmine rezidi ki nesesè pou nsp9 NMPylation ak replikasyon viris nan kilti selilè ki gen mwayen NiRAN.Done yo konfime prediksyon nan résidus sit aktif NiRAN epi yo detèmine wòl enpòtan nan résidus nsp9 N3826 nan nsp9 NMPylation ak replikasyon viris nan vitro.Rezidi sa a se yon pati nan sekans tripeptide NNE N-tèminal konsève e li pwouve li se sèl rezidi nvaryan nsp9 ak homolog li yo nan fanmi coronavirus la.Etid sa a bay yon fondasyon solid pou etid la fonksyonèl nan aktivite NMPylation nan lòt viris enbrike ak pwopoze sib posib pou devlopman nan dwòg antiviral.

Nidovirales pozitif-cheche viris RNA enfekte yon varyete de vertebre ak envètebre (1, 2).Lòd la gen ladan kounye a 14 fanmi (3), yo te etidye anpil fanmi Coronavirus la nan 20 dènye ane yo.Nan epòk sa a, twa kowonaviris zoonotik te parèt nan lame bèt epi yo te lakòz gwo epidemi enfeksyon respiratwa grav nan imen.Ki gen ladan pandemi ki pèsistan ki te koze pa grav maladi enfeksyon egi.Sendwòm Respiratwa Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviris pataje yon òganizasyon genomic komen, epi souinite konplèks replikasyon-transkripsyon manbràn yo (RTC) kode nan de tyè 5-?²-tèminal ak sousinite prensipal estriktirèl patikil viris la, ansanm ak kèk Pwodwi pou Telefòn. .Pwoteyin, ki kode nan 3??² fen twazyèm nan genòm nan (1).Eksepte pou yon fanmi viris planarya (Monoviridae) (8), tout viris enbrike kode RTC sou-inite nan de gwo ankadreman lekti ouvè (ORF) ORF1a ak ORF1b, ki tradui soti nan RNA jenomik nan.ORF1a kode polyprotein (pp) 1a, ak ORF1a ak ORF1b ansanm kode pp1ab.Avèk patisipasyon jeneral nan proteaz prensipal la (Mpro) kode pa ORF1a, tou de pp1a ak pp1ab yo trete proteolitik nan yon varyete pwoteyin ki pa estriktirèl (nsps), ke yo rele tou 3CLpro, paske li gen omoloji ak 3Cpro nan picornavirus la ( 9).Yo panse nsps sa yo reyini nan yon gwo RTC dinamik, katalize sentèz RNA jenomik (replikasyon) ak yon seri RNA subgenomic (transkripsyon), epi yo itilize pou kowòdone ekspresyon ORF ki sitiye en ORF1b (10?? ?12).

RTC debaz la gen ladan RNA-depandan RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) ak plizyè anzim pwosesis RNA, ki sitou kode nan ORF1b ak nan fanmi kowonaviris la. Li genyen nsp12-nsp16 ak nsp9-nsp12 nan fanmi Arterioviridae (gade referans 10âââ 12).RdRp ak HEL1 reprezante de (yon senkyèm) domèn konsève nan viris nich zwazo a epi yo gen omoloji pami lòt viris RNA.Nwayo replicase kwè ke yo dwe ede pa lòt subinit, ki gen ladan plizyè ti nsps lage nan rejyon carboxy-tèminal (C-tèminal) nan pp1a, en nan Mpro (coronavirus nsp5 ak viris atè nsp4, respektivman).Yo gen yon pwoteksyon limite espesifik pou fanmi yo ak aktivite divès (revize nan referans 10ââ12).

Relativman dènyèman, yo te jwenn yon domèn ak karakteristik inik motif sekans nan tèminal amino (N-tèminal) adjasan a RdRp nan tout viris enbrike, men pa gen okenn lòt viris RNA (16).Ki baze sou kote li yo ak aktivite nukleotid transferaz (nukleosid monofosfat [NMP] transferaz), domèn sa a rele NiRAN (Nestvirus RdRp ki gen rapò ak transferaz nukleotid).Konbinezon doub domèn NiRAN-RdRp konstitye nsp12 nan fanmi Coronaviridae ak nsp9 nan fanmi Arterioviridae, ak nan lòt nestoviridae, NiRAN-RdRp espere yo dwe lage kòm yon nsp endepandan nan poliprotein viral la.Nan kowonaviris la, domèn NiRAN gen ??1/450 rezidi epi li konekte ak domèn C-terminal RdRp atravè rejyon linker (16-19).Nan Equine Arteritis Viris (EAV) (Arteriviridae), recombinant nsp9 montre Mn2+ ion-depandan (pwòp tèt ou) UMPylation ak aktivite GMPylation, ki depann sou twa baz sekans konsève nan nestovirus, AN, BN ak CN Résidus yo nan sekans lan.Kote N la vle di NiRAN) (16).N-tèminal flanke nan motif sa yo se yon motif mwens konsèvatif preAN.Gen kèk nan sa yo résidus yo tou konsève nan kinaz pwoteyin ki gen rapò byen lwen, kote yo te montre yo dwe patisipe nan nucleoside triphosphate (NTP) obligatwa ak aktivite katalitik (20, 21).Konfòm ak obsèvasyon sa a, plizyè résidus sit aktif kle nan pseudokinase SelO ki soti nan Pseudomonas syringae ka rasanble ak sipèkonplèks SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ki fèk pibliye.Konsève Coronavirus NiRAN résidus sipèpoze nan mikrostrikti elèktron.Pwoteyin recombinant (17).Yo espekile ke dokimante (pwòp tèt ou) U/GMPylation a pral pwodui yon eta pasajè pou transfere NMP nan substra a (aktyèlman enkoni) (16), ak resanblans estriktirèl ant NiRAN ak pwoteyin kinaz (17, 19) ) Èske ipotèz la ke NiRAN modifye lòt pwoteyin.

Anpil karakteristik, ki gen ladan inik ak inik asosyasyon sistematik li yo ak viris enbrike ak separasyon jenetik ak RdRp, fè NiRAN yon anzim regilasyon kle rezonab pou viris enbrike, ki se kritik nan Aparisyon yo ak idantite yo.Précédemment, yo te rele twa fonksyon posib ki enplike NiRAN pou kontwole tradiksyon genòm/subgenomic oswa replikasyon/transkripsyon.Lè nou konsidere done ki ra ak enkonplè ki disponib nan moman an, chak fonksyon gen avantaj ak dezavantaj li yo (16).Nan rechèch sa a, nou vize pou konbine etid byochimik ak syans jenetik ranvèse kowonaviris yo ki reprezante de jenera yo, epi mete rezilta nou yo nan background evolisyonè nan mitasyon natirèl fanmi kowonaviris yo, pou nou ka jwenn yon insight sou domèn misterye sa a.Nou rapòte gwo pwogrè nan konpreyansyon NiRAN atravè idantifikasyon sib natirèl nan RTC, ki (pami twa ipotèz ki disponib yo) kontribye nan wòl domèn sa a nan kòmanse sentèz viris RNA enbrike.Rechèch sa a tou ouvè posiblite pou lòt wòl NiRAN sou koòdone lame viris la.

Pou ka karakterize pwopriyete anzimatik yo nan domèn NiRAN ki gen rapò ak corona virus nsp12, nou te pwodwi yon fòm recombinant nan kowonaviris imen 229E (HCoV-229E) nsp12 nan E. coli, ak yon tag His6 nan tèminal C a, epi konbine a. pwoteyin ak [α32-P] Enkube ansanm ak NTP nan prezans MnCl2 jan sa dekri nan Materyèl ak Metòd.Analiz pwodwi reyaksyon an te endike prezans yon pwoteyin ki gen radyografi ki ko-migra ak nsp12 (106 kDa), sa ki endike ke coronavirus nsp12 katalize fòmasyon kovalan pwoteyin-NMP adduits, preferans fòme ak uridine monofosfat (UMP) (Figi 1A) Epi B).Analiz quantitative te montre ke konpare ak lòt nukleotid, entansite siyal enkòporasyon UMP ogmante pa 2 a 3 fwa (Figi 1C).Done sa yo konsistan avèk aktivite NMP transferaz prevwa nan domèn NiRAN kowonaviris la (16), men endike preferans nikleotid domèn kowonaviris NiRAN ak viris atè yo diferan.

Aktivite Self-NMPylation nan HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) te enkube ak [α-32P] NTP deziyen an nan prezans 6 mM MnCl2 pou 30 minit (gade Materyèl ak Metòd pou plis detay).Pwodwi reyaksyon yo te separe pa SDS-PAGE ak tache ak Coomassie ble briyan.(B) Pwoteyin ki gen etikèt sou radyografi a parèt ak imaj fosfò.Pozisyon nsp12-His6 ak makè mas molekilè pwoteyin (an kilodalton) yo montre nan A ak B. (C) Yo te detèmine entansite siyal radyo-aktif la (mwayèn ± SEM) apati twa eksperyans endepandan.*P≤0.05.Fòs siyal la (pousantaj) gen rapò ak UTP.

Malgre ke aktivite anzim ki gen rapò ak NiRAN yo montre yo esansyèl pou replikasyon EAV ak SARS-CoV nan kilti selil (16), fonksyon espesifik NiRAN ak sib potansyèl yo poko detèmine.Dènyèman rapòte resanblans estriktirèl ant NiRAN ak yon fanmi pwoteyin ki gen pliye pwoteyin kinaz (17, 22) te pouse nou teste ipotèz NiRAN katalize NMPylation lòt pwoteyin.Nou te pwodwi yon seri sib potansyèl omològ, ki gen ladan pwoteyin ki pa estriktirèl ki kode pa HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), yo chak genyen yon etikèt C-terminal His6 (SI apendis, Tablo S1), epi enkube pwoteyin sa yo ak [α32-P] uridine trifosfat ([α32-P]UTP) nan prezans oswa absans nsp12.Albumin serik bovin ak pwoteyin fizyon MBP-LacZα ki pwodui nan E. coli te sèvi kòm kontwòl (Figi 2A, liy 1 a 7).Pwoteyin radyo-etikèt la te analize pa elektwoforèz jèl sodyòm dodecyl sulfat-polyacrylamid (SDS-PAGE) ak otoryayografi, epi li te jwenn ke te gen yon siyal radyo-aktif fò nan reyaksyon an ki gen nsp12 ak nsp9.Pozisyon siyal la koresponn ak mas molekilè nsp9, sa ki endike UMPylation nsp9-medyatè nsp12 (Figi 2B, tras 7).Pa gen okenn lòt pwoteyin tès yo te jwenn UMPylated, ki te mennen nou konkli ke nsp9 se yon substra espesifik nan nsp12.Konfòm ak done pwòp tèt ou-NMPylation yo montre nan Figi 1, nsp12 kapab transfere tout kat NMP nan nsp9, byenke efikasite a diferan, UMP> adenosine monofosfat (AMP)> guanosine monofosfat (GMP)> cytidine monofosfat (CMP)) ( Foto).3 A ak B).Anba kondisyon yo itilize nan tès sa a (kouse tan reyaksyon ak ekspoze, redwi konsantrasyon nsp12; materyèl ak metòd), pa t 'kapab detekte NMPylation pwòp tèt ou nan nsp12 (konpare Figi 2B, liy 7, ak Figi 1B), ki te pwouve yon efikas (Epi plizyè jij) UMP te deplase soti nan nsp12 a nsp9.Aktivite UMP transferaz mande pou prezans iyon Mn2 +, jan yo montre nan Figi 3C, pandan y ap sèlman aktivite transferaz UMP minim yo te obsève nan prezans Mg2 +, e pa gen okenn aktivite nan prezans de lòt kasyon divalan yo teste.Done menm jan an te jwenn nan tès NMPylation ki gen cytidine trifosfat (CTP), guanosine trifosfat (GTP), ak adenosine trifosfat (ATP) (SI apendis, Figi S1).

HCoV-229E nsp12-medyatè UMPylation nan nsp9.Yo te itilize yon seri de substrats pwoteyin (ki gen ladan albumin serom bovin, MBP-lacZα, ak yon seri de nsps HCoV-229E ki make ak C-terminal His6 kode pa ORF1a) pou evalye aktivite UMPylation nan HCoV-229E nsp12-His6⁺-medyatè. pwoteyin.Enkube pwoteyin nan ak [α-32P] UTP pou 10 minit nan absans (A) oswa prezans (B) nsp12 jan sa dekri nan materyèl ak metòd yo.Nan tèt A ak B, yo montre jèl SDS-polyacrylamid ki tache ak Coomassie Brilliant Blue, epi nan pati anba A ak B yo montre otoradyogram ki koresponn yo.Pozisyon makè mas molekilè pwoteyin (an kilodalton) yo bay sou bò gòch la.Pozisyon nsp12-His6 (B, tèt) ak siyal radyo-aktif yo obsève pandan enkubasyon nsp12-His6 ak nsp9-His6 (B, liy 7) yo endike tou, ki endike [α-32P]UMP pou nsp9-His6. (12.9 kDa), ki pa te obsève pou lòt pwoteyin yo teste.

HCoV-229E NiRAN-medyatè byochimik ak virolojik karakterizasyon nan nsp9 NMPylation.(A ak B) Wòl ko-substra nukleotid yo itilize nan reyaksyon an.Nsp12-His6 ak nsp9-His6 yo melanje ak enkube nan prezans diferan [α-32P] NTP nan tès NMPylation estanda.(A, anlè) Coomassie-stained nsp9-His6 separe pa SDS-PAGE.(A, anba) Otoradyograf nan menm zòn nan jèl la.(B) Aktivite relatif la (mwayèn ± SEM) nan prezans kofaktè nukleotid deziyen an detèmine nan twa eksperyans endepandan.*P≤0.05.(C) Wòl iyon metal yo.Yo montre tès estanda NMPylation nan prezans [α-32P] UTP ak diferan iyon metal, yo chak ak yon konsantrasyon 1 mM.Nan C, anwo a, Coomassie tache nsp9-His6 yo montre, ak nan C, anba a, yo montre otoradiografi ki koresponn lan.Gwosè pwoteyin ki make (an kilodalton) yo montre sou bò gòch A ak C. (D) Fòm mutan HCoV-229E nsp12-His6 ki pote sibstitisyon asid amine espesifye a se nan [α-32P]UTP, jan sa dekri. nan Materyèl ak Metòd.Nsp9-His6 ki gen radyografi ki pwodui nan reyaksyon NMPylation la detekte pa imaj fosforilasyon (D, tèt).Aktivite relatif la konpare ak pwoteyin nan kalite sovaj (wt) yo montre nan D, epi yo pran anba a kòm mwayèn (± SEM) nan twa eksperyans endepandan.Asterisk endike sibstitisyon nan résidus ki pa konsève.(E) Tit viris la nan sipènatant kilti selil p1 yo te jwenn 24 èdtan apre enfeksyon an te detèmine pa tès plak.Yo endike sibstitisyon kodon nan domèn NiRAN nan mutan HCoV-229E enjenyè (nimero rezidi yo baze sou pozisyon yo nan pp1ab).Replikasyon ki manke RdRp sit aktif mutant nsp12_DD4823/4AA yo te itilize kòm yon kontwòl.

Yo nan lòd yo jwenn yon konpreyansyon pi fon sou sit la aktif nan NiRAN epi detèmine résidus ki gen rapò ak aktivite a nan nsp9-espesifik NMP transferase, nou fè analiz mitasyon, nan ki nou ranplase résidus yo konsèvatif nan NiRAN AN, BN ak CN motif. 16) Se Ala (SI apendis, Figi S2).Anplis de sa, enpak konsèvatif sibstitisyon Arg-to-Lys oswa Lys-to-Arg te evalye nan de ka.Kòm yon kontwòl (negatif), résidus ki pa oswa mwens konsève nan domèn kowonaviris NiRAN ak lòt viris enbrike yo ranplase ak Ala. Ranplase K4116A (nan motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif). BN) ak D4280A (CN) siyifikativman diminye oswa menm elimine nsp9 NMPylation atravè nsp12, pandan y ap pwoteyin ak sibstitisyon konsèvatif (R4178K), K4116R) kenbe 60% ak 80% nan aktivite yo, ki endike ke detant nan restriksyon yo sou bò respektif yo. chèn yo se fizikochimik sansib (Figi 3D).Ranplase plizyè lòt rezidi konsève E4145A, D4273A, F4281A ak D4283A se anpil mwens danjere, epi nsp9 UMPylation se sèlman modere redwi.Yo te jwenn rezilta menm jan an nan reyaksyon nsp9 NMPylation ki enplike lòt NTPs (Figi 3D ak SI apendis, Figi S3), ki konfime ke efè yo obsève sou sibstitisyon espesifik asid amine yo endepandan de kalite ko-substra nukleotid yo itilize.Apre sa, nou teste enpak posib sibstitisyon nsp12 sa yo sou replikasyon coronavirus nan kilti selil yo.Pou sa ka fèt, nou te itilize apwopriye jenetikman Enjenieri ADN konplemantè (cDNA) modèl klone nan viris vaccinia recombinant (23, 24) transkri 5 -7 selil yo.Titre nan pitit viris enfektye ki pwodui nan selil sa yo te montre ke pifò mutan HCoV-229E NiRAN pa t posib (Figi 3E).Yon gwoup mutan viral ki pa solid gen ladann altènativ ki montre yo elimine oswa redwi siyifikativman aktivite NMP transferaz nan vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), men gen de lòt altènativ (K4116R, E4145A) % rezève?Aktivite NMPylation in vitro yo sijere ke restriksyon adisyonèl yo enplike.Menm jan an tou, de lòt mitasyon (R4178K, F4281A) ki te lakòz yon diminisyon modere nan aktivite NMPylation in vitro NiRAN te pwodwi viris vivan, sepandan, viris sa yo siyifikativman redwi tit atravè replikasyon.Konfòm ak done aktivite in vitro yo montre nan Figi 3D, ranplase kat lòt résidus ki pa konsève nan kowonaviris ak/oswa lòt viris enbrike (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) te pwodui viris solid Pitit yo, malgre li te genyen. yon tit modere redwi konpare ak viris sovaj la (Figi 3E).

Yo nan lòd yo etidye si aktivite NMP transferase NiRAN-medyatè depann de domèn RdRp aktif la, de rezidi Asp konsève ki enplike nan kowòdinasyon iyon metal divalan (11) nan RdRp motif C yo te ranplase pa Ala. Pwoteyin ki kapab lakòz nsp12_DD4823/4AA kenbe. aktivite nsp9 NMPylation li yo, ki endike ke nsp12-medyatè nan vitro nsp9 NMPylation aktivite pa mande pou aktivite polymerase (SI Apendis, Figi S4).

Apre etabli aktivite NMP transferase nsp9-espesifik pou nsp12, nou te eseye karakterize aduct NMP-nsp9 pa mas spectrométrie (MS).Spectre mas pwoteyin konplè recombinant HCoV-229E nsp9 te montre yon pik nan 12,045 Da (Figi 4A).Anplis de sa nan nsp12 pa t 'chanje bon jan kalite a nan nsp9, ki endike ke nsp12 ak nsp9 pa ta fòme yon konplèks ki estab nan kondisyon yo itilize (denaturasyon) (Figi 4A).Nan prezans UTP ak GTP, mezi mas reyaksyon ki gen nsp9 ak nsp12 respektivman te montre ke mas pwoteyin UTP te deplase 306 Da, ak mas pwoteyin GTP te deplase 345 Da, sa ki endike chak molekil nsp9 mare yon UMP oswa GMP. (Foto 4) C ak D).Yo espekile ke enèji ki nesesè pou nsp9 NMPylation ki gen mwayen NiRAN soti nan idroliz NTP ak lage pirofosfat.Malgre ke yon eksè 10-pliye molè nan nsp9 (sib) pase nsp12 (anzim) yo te itilize nan reyaksyon sa a, prèske konplè NMPylation nan nsp9 yo te obsève, ki endike ke entèraksyon ki genyen ant nsp12 ak nsp9 se kout, ak nsp12 ka NMPylate plis nsp9. in vitro molekil.

Single NMPylation nan nsp9 nan prezans nsp12 ak UTP oswa GTP.Yo montre spectre mas pwoteyin konplè dekonvolute HCoV-229E nsp9 (SI apendis, Tablo S1) (AD).(A) nsp9 pou kont li, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 nan prezans UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 nan prezans GTP.

Pou detèmine résidus nsp9 UMPylated pa nsp12, nsp9-UMP te fennen ak tripsin.Peptides ki kapab lakòz yo te separe pa nano-wo pèfòmans likid chromatografi (HPLC) ak analize pa tandem mas spèktrometri (MS / MS) sou entènèt.Analiz done lè l sèvi avèk pake lojisyèl Byonic (Metris Pwoteyin) te montre UMPylation nan asid amine N-tèminal la.Sa a se konfime manyèlman.Tandem mas spectre nan peptide precurseur [UMP] NNEIMPGK (SI apendis, Figi S5A) revele yon fragman nan 421 m / z, ki endike ke UMP mare nan rezidi 1 nan nsp9.

Nan N-tèminal nsp9, Asn konsève pami manm Orthocoronavirinae (SI apendis, Figi S6).Malgre ke nou kwè ke N-tèminal prensipal nitwojèn amine a se akseptè ki gen plis chans pou UMP, nou deside jwenn plis prèv nan NMP obligatwa nan N-tèminal la.Pou rezon sa a, ki pa NMPylated ak NMPylated N-terminal peptide nsp9 pirifye pa HPLC te sòti nan prezans asetòn ak sodyòm cyanoborohydride.Nan kondisyon sa yo, sèlman gratis amine prensipal yo ka modifye ak pwopil (25).N-tèminal nsp9-deriv peptide a ak sekans NNEIMPGK la gen de amine prensipal, youn nan N-tèminal Asn ak lòt la nan chèn bò Lys nan C-tèminal la.Se poutèt sa, gwoup pwopil yo ka prezante nan tou de bout.Kwomatogram iyon extrait nan peptides ki pa NMPylated yo montre nan apendis SI a, Figi S5B.Kòm espere, N-tèminal ak C-tèminal (mono) propylated (SI apendis, Figi S5B, liy anwo) ak dipropylated peptides (SI apendis, Figi S5B, liy pi ba) ka idantifye.Modèl sa a chanje ak itilizasyon peptide NMPylated N-tèminal nsp9 la.Nan ka sa a, yo ka idantifye sèlman C-terminal peptides propylated, men N-terminal peptides propylated ak peptides dipropylated yo pa idantifye (SI Apendis, Figi S5C), ki endike ke UMP te transfere nan N-terminal amine prensipal la Pou anpeche sa a. gwoup soti nan fè chanjman.

Apre sa, nou ranplase (ak Ala oswa Ser) oswa efase résidus yo konsève nan N-tèminal nsp9 pou defini kontrent sib espesifik.Baze sou done MS nou yo ki montre ke NiRAN fòme yon adduct nsp9-NMP ak amine prensipal rezidi N-tèminal nsp9 la, nou te sipoze ke nsp9 NMPylation mande pou pwoteyaz mèt viral (Mpro, nsp5) pou libere N-tèminal nsp9 nan. précurseur polyprotein li yo.Pou teste ipotèz sa a, nou te pwodwi yon pwoteyin précurseur nsp7-11 ki gen nsp9 nan E. coli epi nou te fè yon tès estanda NMPylation nan prezans [α-32P] UTP (materyèl ak metòd).Jan yo montre nan Figi 5A (liy 3), précurseur nsp7-11 ki pa koupe a pa gen etikèt sou radyo ak nsp12.Kontrèman, si nsp7-11 k ap koupe pa recombinant nsp5 pou libere nsp9 (ak lòt nsps) soti nan précurseur a, yo detekte yon pwoteyin radyo-marke ki emigre ak nsp9, sa ki konfime konklizyon nou an ke NiRAN ak N-selektif fòmasyon nan adducts nsp9-NMP kovalan. .Amine prensipal tèminal N-tèminal Asn (pozisyon 3825 nan pp1a/pp1ab).Konklizyon sa a sipòte tou pa eksperyans lè l sèvi avèk nsp9 konstwi a, ki gen youn oswa de résidus adisyonèl nan N-tèminal la.Nan tou de ka yo, yo te aboli UMPylation nsp9 ki gen mwayen NiRAN (SI Apendis, Figi S7).Apre sa, nou te pwodwi yon pwoteyin ak youn oswa de résidus Asn efase nan sekans peptide 3825-NNEIMPK-3832 nan N-tèminal nsp9 la.Nan de ka yo, nsp9 UMPylation te konplètman bloke (Figi 5B), bay prèv adisyonèl ke reyèl nsp9 N-tèminal la aji kòm yon reseptè NMP.

Pwosesis pwoteolitik nan nsp9 ak wòl nan résidus N-tèminal nan nsp12-medyatè UMPylation.(A) nsp9 UMPylation mande pou yon nsp9 N-tèminal gratis.Nsp7-11-His6 pre-enkube nan 30 °C nan tanpon deteksyon NMPylation ki gen UTP nan prezans oswa absans recombinant Mpro (nsp5-His6).Apre 3 èdtan, kòmanse tès NMPylation la lè w ajoute nsp12-His6 jan sa dekri nan Materyèl ak Metòd.Reyaksyon ki gen nsp5-His6 (liy 1) ak nsp9-His6 (liy 2) te itilize kòm yon kontwòl.Apre 10 minit, reyaksyon an te sispann epi melanj reyaksyon an te separe pa SDS-PAGE.Pwoteyin nan te tache ak Coomassie Brilliant Blue (A, tèt).Précurseur Nsp7-11-His6 ak pwodwi trete ki soti nan klivaj medyatè nsp5-His6 yo montre sou bò dwat la.Tanpri sonje (akòz ti gwosè yo) ke nsp7 ak nsp11-His6 pa detekte nan jèl sa a, epi reyaksyon an konplete ak nsp5-His6 (liy 1 ak 4; pozisyon nsp5-His6 endike pa yon sèk solid) oswa nsp9-His6 (Lane 2) gen yon ti kantite MBP (ki endike pa sèk ouvè) kòm enpurte rezidyèl paske yo eksprime yo kòm pwoteyin fizyon MBP (SI apendis, Tablo S1).(B) Variant Nsp9-His6 a manke youn oubyen de résidus Asn N-tèminal (nimero rezidi yo dapre pozisyon nan pp1a/pp1ab) epi li pirifye epi enkube ak nsp12-His6 ak [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE tache ak Coomassie yo montre nan tèt la, B, yo montre otoradyograf ki koresponn lan anba a.Pozisyon makè pwa molekilè a (an kilodalton) yo montre sou bò gòch la.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-tèminal konsève rezidi yo te ranplase ak Ala oswa Ser, epi yo te itilize menm kantite pwoteyin nan reyaksyon UMPylation nsp12-His6 medyatè.Pwodwi reyaksyon yo te separe pa SDS-PAGE ak tache ak Coomassie Brilliant Blue (C, tèt), ak radyolabeled nsp9-His6 te detekte pa fosforesans D (C, mitan).Sèvi ak sovaj-kalite (wt) pwoteyin kòm yon referans (mete a 100%), aktivite a relatif NMPylation (vle di ± SEM) te kalkile nan twa eksperyans endepandan.(D) Titer viris nan supernatant kilti selil p1 selil Huh-7 ki enfekte ak selil Huh-7 HCoV-229E sovaj, ak mutan ki gen sibstitisyon deziyen asid amine nan nsp9 yo te detèmine pa tès plak.RdRp motif C doub mutan DD4823/4AA te itilize kòm yon kontwòl negatif.

N-tèminal nsp9 (sitou pozisyon 1, 2, 3, ak 6) trè konsève pami manm sou fanmi Orthocoronavirinae (SI apendis, Figi S6).Yo nan lòd yo etidye wòl nan posib nan résidus sa yo nan nsp12-medyatè nsp9 NMPylation, de rezidi Asn youn apre lòt nan N-tèminal la nan nsp9 yo te ranplase ak Ala oswa Ser (pou kont li oswa nan konbinezon).Konpare ak nsp9 kalite sovaj, ranplase N3825 ak Ala oswa Ser te lakòz plis pase yon rediksyon de fwa nan UMPylation nsp12-medyatè (Figi 5C).Konfòm ak konklizyon nou an ke NMPylation rive nan N-tèminal prensipal amine olye pou yo chèn bò nan rezidi N-tèminal la, nou obsève siyifikatif rezidyèl NMPylation ak ranplasman N3825A ak N3825S.Enteresan, si dezyèm Asn an ranplase pa Ala oswa Ser, nsp9 UMPylation redwi pi fò (plis pase 10 fwa), pandan ke ranplasman Ala nan pozisyon 3, 4, ak 6 gen sèlman yon efè modere sou nsp9 UMPylation (Figi 2). ).5C).Rezilta menm jan an te jwenn lè l sèvi avèk ATP, CTP oswa GTP (SI apendis, Figi S8).Ansanm, done sa yo endike wòl kle N2826 (pozisyon 2 nan nsp9) nan nsp9 NMPylation.

Pou nou ka jwenn plis prèv ki montre korelasyon fonksyonèl ant N-tèminal nsp9 ak NMPylation, nou te fè yon aliyman sekans miltip (MSA) nan sekans nsp9 fanmi Coronavirus (varye ant 104 ak 113 résidus) (SI Apendis, Figi). S6).An total, nan 47 espès (li te ye ak swadizan) nan 5 jenera nan soufanmi Orthocoronavirinae ki enfekte diferan mamifè, zwazo, ak lame reptil yo, sèlman 8 résidus nan total yo te jwenn ki pa varye.Chanjman ki pi vaste, ki gen ladan sipresyon ak ensèsyon, yo te obsève nan sik ki genyen ant eleman estrikti segondè nan nsp9, jan yo detèmine pa etid estriktirèl anvan yo (26 ??28).Yo te jwenn senk résidus invariant nan β strand ak α helix nan pati C-tèminal nsp9 la.Twa résidus invariant konstitye motif NNE nan tèminal N nan nsp9.Li revele ke dezyèm Asn nan motif sa a se sèl rezidi invariant, ki pataje tou pa ipotetik nsp9 nan kowonaviris krapo ki gen rapò byen lwen, epi li reprezante espès Microhyla letovirus 1 nan subfanmi Letovirinae nan Alphaletovirus.Konsèvasyon nan résidus nan nsp9 eleman estrikti segondè yo ka rasyonèl pa konsiderasyon estriktirèl yo kenbe plisman oswa li te ye RNA pwopriyete obligatwa.Sepandan, rezònman sa a pa sanble aplike nan konsèvasyon nan NNE, e anvan etid sa a, nati a nan kontrent yo ki limite varyasyon nan sekans nan tripeptide te konplètman bouche.

Pou detèmine enpòtans nsp9-NMPylation ak konsèvasyon NNE nan replikasyon coronavirus, nou pwodui mutan HCoV-229E, ki pote yon sèl oswa doub sibstitisyon nan nsp9 N-tèminal résidus, ki endike ke nsp9 NMPylation danjere nan vitro.Anvan nou kòmanse, nou eseye reponn kesyon an si sibstitisyon sa yo (tou pre sit klivaj nsp8|9 la) afekte pwosesis proteolitik nan rejyon C-terminal pp1a.Yon seri nsp7-11 polyprotein konstwi ki gen sibstitisyon korespondan nan N-tèminal nsp9 yo te pwodwi nan E. coli epi koupe ak recombinant Mpro.Klivaj pwoteolitik kat sit yo (ki gen ladan sit la nsp9 flanke) pa siyifikativman afekte pa okenn ranplasman prezante (SI apendis, Figi S9), eksepte chanjman estriktirèl nan pwoteyin sa yo ki entèfere ak Mpro-medyatè nsp8 | 9 klivaj (oswa lòt) sit entènèt.

Selil Huh-7 yo te transfekte ak RNA HCoV-229E ki gen longè jenom, ki kode sibstitisyon Ala oswa Ser nan tripeptides NNE konsève (N3825, N3826, ak E3827) nan tèminal nsp9 N, ki montre ke pi fò nan mitasyon yo fatal.Nou te kapab sove viris la nan ranplase Ser oswa Ala nan N-tèminal Asn (N2835A oswa N2835S), men echwe pou refè viris la ak lòt mitasyon sèl ak doub nan sekans NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figi 5D).

Rezilta sa yo endike ke replikasyon kowonaviris yo nan kilti tisi yo gen restriksyon (menm oswa menm jan an), sa ki limite mitasyon natirèl nan sit nsp9 NMPylation nan kò a, epi sipòte wòl kle repons sa a nan sik lavi kowonaviris yo.

Nan dènye seri eksperyans yo, nou te pwodwi C-terminal His6 ki make SARS-CoV-2 nsp12 ak nsp9, ak de fòm mutan nsp12 nan E. coli.Résidus sit aktif yo nan domèn NiRAN ak RdRp yo te respektivman Sèvi ak Ala olye (Figi 6A ak SI apendis, Tablo S2).K4465 nan SARS-CoV-2 nsp12 koresponn ak K4135 nan HCoV-229E (SI Apendis, Figi S2), ki pwouve yo dwe obligatwa pou aktivite NiRAN ak replikasyon HCoV-229E (Figi 3D ak E).Résidus sa a tou koresponn ak atè viris EAV nsp9 K94 résidus, ki te deja montre nesesè pou NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16).Jan yo montre nan Figi 6B, SARS-CoV-2 nsp12 gen aktivite transferaz UMP lè l sèvi avèk nsp9 kòm yon substra, pandan y ap mutan sit aktif nsp12_K4465A a inaktif.Sibstitisyon an doub nan sekans karakteristik SDD nan RdRp motif C pa afekte aktivite transferaz UMP (Figi 6B), ki endike ke aktivite RdRp pa gen okenn efè dirèk nan nsp9 UMPylation.Done menm jan an te jwenn lè l sèvi avèk CTP, GTP ak ATP (SI apendis, Figi S10).An rezime, done sa yo endike ke NMPylation nsp9 medyatè NiRAN gen yon aktivite konsèvatif nan kowonaviris ki reprezante diferan jener sou fanmi orthocoronavirus.

SARS-CoV-2 nsp12-medyatè NMPylation nan nsp9.(A) Coomassie tache jèl SDS-polyacrylamide ki montre pwoteyin recombinant yo itilize nan tès NMPylation la.Kòm yon kontwòl, yo te itilize yon pwoteyin mutan ak sibstitisyon sit aktif nan domèn NiRAN (K4465A) ak domèn RdRp (DD5152/3AA) nan SARS-CoV-2 nsp12.Nimero rezidi yo baze sou pozisyon nan pp1ab.(B) Otoradyograf deteksyon UMPylation lè l sèvi avèk nsp9-His6 ak [α-32P]UTP kòm substra nsp12-His6 (tip sovaj [wt] ak mutan).Yo montre mas molekilè (an kilodalton) pwoteyin ki make sou bò gòch la.

Domèn NiRAN yo jeneralman konsève nan Nidovirales (16), ki endike ke yo katalize reyaksyon anzimatik esansyèl pou replikasyon Nidovirus.Nan etid sa a, nou te kapab pwouve ke domèn NiRAN nan kowonaviris la transfere NMP (pwodwi soti nan NTP) nan nsp9, yon misterye pwoteyin obligatwa RNA ki enplike nan replikasyon viris (26 ?? 29 ), pou detèmine li kòm yon sib natirèl ak patnè coronavirus RTC.

Domèn NiRAN pataje twa motif sekans (AN, BN, ak CN), ki gen yon ti kantite rezidi ki konsève nan tout fanmi nan lòd Nidovirales monofiletik men trè différenciés (8, 16).Dènye etid yo te montre ke yo estriktirèl ki gen rapò ak yon fanmi lajman uncharacterized nan pwoteyin kinaz-tankou pwoteyin, ki te orijinèlman rele fanmi SelO (17, 19, 22, 30, 31).Pwoteyin ki gen rapò ak SelO gen pli kinaz, men yo manke plizyè rezidi sit aktif konsève nan kinaz klasik (22, 32).Baze sou oryantasyon ranvèse nan molekil ATP ki mare nan sit aktif la ak estabilize pa entèraksyon espesifik, SelO te ipotèz epi imedyatman konfime ke yo transfere AMP (olye pou yo fosfat) nan substra pwoteyin lan (22), pandan y ap gen yon lòt bakteri SelO ki tankou pwoteyin YdiU. dènyèman yo te montre yo katalize atachman kovalan nan UMP ak Tyr ak résidus li nan diferan substrats pwoteyin (33).

Pou konfime ak elaji prediksyon rezidi sit aktif yo nan domèn coronavirus NiRAN, nou te itilize metòd byochimik ak jenetik ranvèse pou fè analiz mitasyon sou coronavirus nsp12 (Figi 3D ak E ak SI apendis, Figi S3 ak tablo) S1â. S4).Done yo montre ke ranplasman HCoV-229E K4135, R4178 ak D4280 ak Ala elimine aktivite NMP transferaz in vitro ak replikasyon viris nan kilti selil (Figi 3D ak E ak SI apendis, Figi S3), sipòte prezans yo nan NTP γ-fosfat. (K4135, R4178) ak kowòdinasyon iyon metal sit aktif (D4280).Yo te montre sibstitisyon E4145A nan Glu konsève nan seri viris nich zwazo ki te prevwa pou estabilize pozisyon K4135 (17) la pou elimine replikasyon viral, men etonan, aktivite a te kenbe nan tès NMPylation in vitro (Figi 3D ak E ak SI anèks, Figi S3 ak Tablo S1–S4).Yo te fè yon obsèvasyon menm jan an lè yo te prezante sibstitisyon ki koresponn lan nan omolog YdiU Salmonella typhimurium (E130A) (33).Ansanm, done sa yo sipòte fonksyon regilasyon sa a rezidi konsève olye ke fonksyon katalitik la.

Ranplase rezidi Phe ki konsève (F4281A) nan seri nestovirus nan domèn HCoV-229E NiRAN (8) te lakòz yon diminisyon nan aktivite NMPylation an vitro ak yon diminisyon enpòtan nan replikasyon viris nan kilti selilè (Figi 3D, E ak SI) apendis, Figi S3).Done yo konsistan avèk fonksyon regilasyon enpòtan sa a rezidi, tankou rezidi Phe omologu DFG motif yo te montre deja.Nan kinaz pwoteyin klasik, li se yon pati nan bouk obligatwa Mg2 + epi li ede rasanble ak kontwole kolòn vètebral la???Obligatwa pou aktivite katalitik efikas (32, 34).Ranplase Ala ak Arg pou résidus K4116 (nan motif preAN), respektivman, elimine replikasyon viral epi, jan yo espere, te gen efè diferan sou aktivite NMP transferaz nan vitro, tou depann de chèn bò asid amine prezante (Figi 3D ak E ak apendis SI). , Figi S3).Done fonksyonèl yo konsistan avèk enfòmasyon estriktirèl la, ki endike ke rezidi sa a te etabli yon entèraksyon ak ATP fosfat (17).Nan domèn NiRAN nan lòt fanmi viris nich, pozisyon HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 okipe pa Lys, Arg oswa His (8), ki endike ke restriksyon fonksyonèl rezidi espesifik sa a te rilaks.Ranplasman D4188A ak D4283A elimine oswa redwi anpil aktivite anzim epi elimine replikasyon viris (Figi 3).De résidus sa yo konsève nan pifò (men se pa tout) viris enbrike (8), ki endike yon fonksyon enpòtan fanmi-espesifik men pètèt ki pa katalitik.Ala ranplasman plizyè lòt Lys ak Asp rezidi (K4113A, D4180A, D4197A ak D4273A) ki pa konsève nan Coronaviridae oswa lòt fanmi Nestioviridae (8) yo te itilize kòm kontwòl.Kòm espere, sibstitisyon sa yo se lajman tolerab, ak yon ti diminisyon nan aktivite anzim ak replikasyon viral nan kèk ka (Figi 3 ak SI apendis, Figi S3).An jeneral, done mutajenèz kowonaviris yo trè konsistan avèk pwòp GMP ak done jenetik ranvèse EAV NiRAN-RdRp (16), kote EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) rezidi K94 (ki koresponn ak HCoV-229E K4135) fonksyon enpòtan), R124 (korespondan ak R4178), D132 (korespondan ak D4188), D165 (korespondan ak D4280), F166 (korespondan ak F4281).Anplis de sa, done mutajenèz HCoV-229E yo konsistan ak elaji nan done jenetik ranvèse SARS-CoV yo te rapòte deja (16), menm jan ak sa yo obsève pou korespondan CN motif Phe-to-Ala mutan SARS-CoV_nsp12 la. fenotip dekri -F219A ak HCoV-229E_F4281A (Figi 3 D ak E ak SI apendis, Figi S3 ak Tablo S1-S4).

Konpare ak ortholog EAV (16), ki gen yon preferans klè pou UTP ak GTP (nan reyaksyon pwòp tèt ou-NMPylation), etid nou an montre ke domèn coronavirus NiRAN (reprezante pa HCoV-229E ak SARS-CoV-2) ka efektivman. transfere Tout kat NMP yo, byenke gen yon ti preferans pou UMP (Figi 1 ak 3).Espesifik relativman ba nan ko-substra NTP espesifik la ki konsistan avèk estrikti sipèkonpozisyon SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ki fèk rapòte, nan ki ADP-Mg2 + mare nan sit aktif NiRAN, men se pa ak pati adenin. nan fòmasyon nan entèraksyon espesifik (17).Nan etid nou an, ki kalite nukleotid yo itilize nan reyaksyon NMPylation pa gen okenn efè diferans sou aktivite pwoteyin mutan an (SI Apendis, Figi S3), ki endike ke pa gen youn nan résidus sa yo ki gen rapò sere ak obligatwa nan yon nukleobaz espesifik.Baz estriktirèl ak potansyèl siyifikasyon byolojik diferan NTP preferans ko-substra yo obsève nan domèn NiRAN nan coronavirus ak viris atè yo rete yo dwe etidye;yo ka vre oswa yo ka akòz limit yo nan etid respektif yo.Kounye a, li pa ka ekskli ke aktivite potansyèl NMPylator nan domèn viris atè NiRAN (konpare ak aktivite pwòp tèt ou-NMPylation ki te deja karakterize) gen yon preferans diferan ko-substra, pran an kont ke resanblans ant atè a ak coronavirus la. Domèn NiRAN nan limit li.Konpare ki baze sou sekans (16).Konpare ak pseudokinase SelO a, ki itilize Mg2 + kòm yon kofaktè, aktivite coronavirus ak viris atè NiRAN depann sou Mn2 + (16) (Figi 3C ak SI apendis, Figi S1).Depandans nan Mn2 + ak preferans evidan pou UTP se yon karakteristik etranj nan pwoteyin NMPylators, epi li te sèlman dènyèman konfime nan pwoteyin YdiU nan Salmonella typhimurium, ki katalize strik Mn2 +-depandan pwoteyin chaperone UMPylation la pou pwoteje selil yo kont endiksyon estrès selil ATP pisin ( 33).

Resanblans estriktirèl ki te dekri dènyèman ant domèn coronavirus NiRAN ak pwoteyin kinaz selilè (17, 19) bay plis sipò pou kapasite NiRAN pou lyen kovalan NMP ak lòt pwoteyin nou te rapòte nan etid sa a.Nou konsantre rechèch nou an pou objektif NiRAN posib sou pwoteyin HCoV-229E ORF1a kode yo, ke yo konnen dirèkteman oswa endirèkteman ede kopiz ORF1b-kode RTC a (12, 35).Eksperyans nou yo bay prèv konklizyon pou NMPylation efikas ak espesifik nan nsp9 (Figi 2).Si yo itilize pwoteyin sib la nan yon eksè molè ki 8 a 10 fwa pi wo pase anzim nan (nsp12), li konfime ke nsp9 konplètman (mono)NMPized (Figi 4).Nou konkli ke entèraksyon ki genyen ant nsp12 ak nsp9 se kout epi yo pa pral fòme yon konplèks ki estab ak nsp9 (nan absans lòt subinite RTC).Konklizyon sa a sipòte pa etid entèraksyon pwoteyin sou proteom SARS-CoV (35).Analiz MS idantifye amine prensipal rezidi N-tèminal nsp9 kòm sit NMPylation (SI apendis, Figi S5).Fòmasyon kosyon fosforamidat la ak gwoup amine N-tèminal la fè distenksyon ant aktivite NMPylation ki gen mwayen NiRAN ak reyaksyon AMPylation Pseudomonas syringae SelO-medyatè, ki katalize fòmasyon AMP ki lye O nan Ser, Thr, oswa Tyr rezidi Peptide adduct ( 22), ak S. typhimurium YdiU fòme O-lye (ak Tyr) ak N-lye (ak His) peptide-UMP adducts.Enfòmasyon limite ki disponib sou fanmi pwoteyin SelO a endike ke manm gwo fanmi pwoteyin sa a diferan anpil nan fòmasyon peptide-NMP adducts.Sa a se yon obsèvasyon enteresan ki merite plis etid.

Done yo jwenn nan etid sa a te mennen nou nan ipotèz ke NMPylation nan nsp9 mande pou yon N-tèminal gratis.Nan yon kontèks replikasyon viral, sa a pral bay pa klivaj pwoteolitik nan sit la pwosesis nsp8|nsp9 nan polyprotein replicase pp1a medyatè pa Mpro ak pp1ab.Nan pifò coronavirus, diferans ki genyen ant sit espesifik sa a (VKLQ|NNEI nan HCoV-229E) ak tout lòt sit kowonaviris Mpro se Asn (olye ke yon lòt ti rezidi, tankou Ala, Ser Oswa Gly) okipe P1â???Kote (36).Done klivaj peptide yo te jwenn nan etid yo byen bonè te montre ke efikasite klivaj nan sit nsp8|nsp9 la te pi ba pase sa yo ki nan lòt sit, ki endike ke 1) sit espesifik sa a ka gen yon wòl regilasyon nan pwosesis la alè kowòdone nan C-tèminal la. pp1a rejyon, oswa 2) a Wòl espesyal nsp9 N-tèminal konsève nan replikasyon viris (37).Done nou yo (Figi 5A) te montre ke fòm recombinant nsp9 ki pote sekans reyèl N-tèminal la te efektivman NMPized pa nsp12.Faktè Xa (nsp9-His6; SI apendis, Tablo S1) oswa Mpro-medyatè klivaj (nsp7-11-His6; Figi 5A ak SI apendis, Tablo S1) te retire sekans N-tèminal la.Sa ki enpòtan, précurseur nsp7-11-His6 ki gen nsp9 ki pa koupe a te montre rezistans nan NMPylation nan nsp12, ki konsistan avèk done nou yo, ki endike ke adduct nsp9-NMP a fòme atravè amine prensipal N-terminal (SI apendis, Figi S5) .Pou jwenn yon konpreyansyon pi fon sou espesifik NiRAN substra, nou Lè sa a, konsantre sou résidus N-tèminal adjasan yo nan nsp9.Nan absans lòt pwoteyin, yo estriktirèl fleksib, anpeche yo detekte nan fòm nan san etikèt nan nsp9 (26 28, 38), ki endike varyasyon limite natirèl yo. fonksyon fragman N-tèminal nsp9 la.Ala ranplasman nan rezidi konsève nan rejyon sa a (Figi 5C ak D ak SI apendis, Figi S8) revele ke N3826 esansyèl pou nsp9 NMPylation nan vitro, pandan y ap sibstitisyon N3825A ak E3827A mennen nan yon diminisyon nan NMPylation, pandan y ap sibstitisyon M3829A ak P3830A pa fè sa. .Li evidan afekte nsp9 NMPylation.Malgre ke sibstitisyon an nan N-tèminal Asn (N3825A, N3825S) gen sèlman yon efè modere sou nsp9 NMPylation ak replikasyon viris nan kilti selil (Figi 5C ak D), efase yon sekans rezidi Asn nan N-terminal 3825-NN dipeptide a. Li se letal nan viris, ki endike ke yon sèl rezidi Asn obligatwa anvan yon lòt rezidi nan N-tèminal la, de preferans Asn, byenke li sanble ke sibstitisyon nan rezidi menm jan an ka pasyèlman tolere (Figi 5B, C, ak D).Nou konkli ke dipeptide 3825-NN a, espesyalman rezidi N3826 ki konsève ak esansyèl nan seri coronavirus la (apendis SI, Figi S6), asire lyezon kòrèk ak oryantasyon tèminal nsp9 N nan sit aktif NiRAN.

Ranplase Ala (E3827A) pou Glu konsève nan tout soufanmi yo kenbe nsp9 NMPylation nan vitro men se letal nan viris nan kilti selil (Figi 5C ak D), ki endike fonksyon adisyonèl nan rezidi sa a, pou egzanp, nan entèraksyon kle (NMPylated oswa san modifye). ) nsp9 N-tèminal ak lòt faktè ki enplike nan replikasyon viris.Mitasyon Nsp9 yo pa t afekte pwosesis pwoteolitik nsp9 oswa nenpòt nsps adjasan (39) (SI Apendis, Figi S9), ki endike ke fenotip letal plizyè mitasyon nsp9 yo obsève pa te koze pa dysregulation nan zòn nan pwosesis C proteolytic-tèminal pp1a. .

Done ki anwo yo bay prèv ke apre tretman Mpro-medyatè nan sit la klivaj nsp8 | 9 nan pp1a / pp1ab, N-tèminal la nan nsp9 ka UMPylated (oswa pasyèlman modifye ak yon lòt NMP).Anplis de sa, konsèvasyon ekselan nan tèminal N nan nsp9 (ki gen ladan rezidi Asn sengilye ak envaryab nan fanmi coronavirus la) ak done jenetik ranvèse yo te jwenn nan etid sa a (Figi 3E ak 5D) te mennen nou konkli ke nsp9 NMPylation ki dekri a. se biyolojik ki gen rapò ak esansyèl pou replikasyon coronavirus.Konsekans fonksyonèl modifikasyon sa a rete yo dwe etidye, pou egzanp, konsènan aktivite a obligatwa RNA (2628) nsp9 (ki pa espesifik) ki dekri deja (ki pa modifye).N-tèminal NMPylation ka afekte tou entèraksyon nsp9 ak substrats pwoteyin oswa RNA oswa fòmasyon diferan asanble kat nivo.Sa yo te obsève nan etid estriktirèl epi yo te konfime yo dwe fonksyonèl ki gen rapò ak replikasyon coronavirus, byenke espesyalman nan absans la nan Nan ka modifikasyon sa a (26-ââ29, 40).

Malgre ke espesifik sib nan domèn coronavirus NiRAN toujou bezwen karakterize an plis detay, done nou yo montre ke espesifik sib pwoteyin nan domèn coronavirus NiRAN se trè etwat.Malgre ke konsèvasyon nan résidus sit kle aktif (8, 16) nan domèn NiRAN nan tout fanmi nidoviris fòtman sipòte aktivite a nan NMPylator la konsève pwoteyin sa yo, idantite a nan substra obligatwa rezidi pòch nan domèn sa a Konsèvasyon ak konsèvasyon rete yo dwe karakterize , epi yo ka diferan ant diferan fanmi nan rezon Nidovirales.Menm jan an tou, sib ki enpòtan nan lòt viris nich yo poko detèmine.Yo ka òtològ aleka nan nsp9 oswa lòt pwoteyin, paske sekans yo deyò senk domèn yo replik ki jeneralman konsève nan viris enbrike yo mwens konsève (8), ki gen ladan etalaj la genòm ant Mpro ak NiRAN, Pami yo, nsp9 sitiye nan la. kowona viris.

Anplis de sa, nou pa kapab kounye a ekskli posiblite pou domèn NiRAN gen sib adisyonèl (ki gen ladan selilè).Nan ka sa a, li vo mansyone ke omològ yo bakteri nan sa a émergentes pwoteyin NMPylators (NMPylators) (30, 31) sanble yo gen "mèt regilatè"?NMP modile yon varyete pwoteyin selilè pou kontwole oswa elimine aktivite en yo, kidonk jwe yon wòl nan yon varyete de pwosesis byolojik, tankou repons estrès selilè ak omeyostazi redox (22, 33).

Nan etid sa a (Figi 2 ak 4 ak SI Apendis, Figi S3 ak S5), nou te kapab pwouve ke nsp12 transfere pati UMP (NMP) nan yon pozisyon sèl (konsève) nan nsp9, pandan ke lòt pwoteyin pa te modifye nan la. itilize Anba kondisyon yo, byen defini (olye ke ki lach) espesifik substra yo sipòte.Konfòm ak sa a, konpare ak N-tèminal nsp9 NMPylation, pwòp aktivite NMPylation nsp12 a trè ba, deteksyon li mande pou tan ekspoze otoradografi pi long, epi yo itilize yon ogmantasyon 10 fwa nan konsantrasyon nsp12.Anplis de sa, analiz MS nou an echwe pou pou bay prèv pou NMPylation nan nsp12, ki sijere ke domèn NiRAN pwòp tèt ou-NMPylation se (nan pi bon) yon aktivite segondè.Sepandan, li ta dwe remake ke lòt etid yo te bay prèv preliminè ke estati pwòp tèt ou-AMPylation nan bakteri NMPylator ka kontwole aktivite NMPylation yo sou lòt substrats pwoteyin (22, 33).Se poutèt sa, gen plis rechèch ki nesesè pou mennen ankèt sou efè fonksyonèl posib nan aktivite pwòp tèt ou-NMPylation rapòte pou EAV nsp9 (16) ak coronavirus nsp12 (etid sa a), ki gen ladan efè chaperone ki pwopoze a sou plisman nan domèn C-terminal RdRp la ( 16)).

Précédemment, yo te konsidere plizyè ipotèz konsènan fonksyon posib en domèn nidoviral NiRAN, tankou RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase ak aktivite priming pwoteyin (16), men okenn nan yo pa konpatib ak fonksyon en disponib.Enfòmasyon yo jwenn nan pozisyon sa yo se egzakteman menm tan an san yo pa fè sipozisyon adisyonèl.Done yo jwenn nan etid sa a pi konsistan avèk (men yo pa ka pwouve) ke domèn NiRAN patisipe nan inisyasyon sentèz RNA pwovoke pwoteyin.Li te deja kwè ke fonksyon an nan domèn nan NiRAN nan 5??²-RNA capping oswa reyaksyon ligasyon RNA pa afekte pa sa yo ak sipò nan lòt done.Se poutèt sa, pou egzanp, sit aktif NiRAN yo konsidere kòm enplike Asp la konsève kòm yon baz jeneral (D252 nan Pseudomonas syringae SelO; D4271 nan HCoV-229E pp1ab; D208 nan SARS-CoV-2 nsp12) (SI Apendis, figi 2). ).S2) (17, 22, 33), pandan ke kataliz la nan RNA ligase depandan ATP ak RNA capping anzim te pote soti nan anzim kovalan-(lysyl-N)-NMP entèmedyè, ki enplike yon rezidi Lys ki pa chanje ( 41).Anplis de sa, espesifik espesifik ki baze sou sekans remakab nan coronavirus NiRAN pou sib pwoteyin konsève ak spesifik rilaks pou NTP ko-substra (prefere UTP) opoze anzim kapping medyatè NiRAN oswa fonksyon RNA ligase-like.

Li evidan, yon anpil nan travay siplemantè bezwen verifye epi, si pwouve, elabore sou wòl nan posib nan nsp9-UMP (nsp9-NMP) nan sentèz RNA pwoteyin-induit, ki pral konekte plizyè rapò enteresan men (jiskaprezan) rapòte deja. .Obsèvasyon izole.Pou egzanp, li te detèmine ke fen RNA negatif nan kowonaviris la kòmanse ak yon strand oligo(U) (42, 43).Obsèvasyon sa a ki konsistan avèk lide ke sentèz RNA negatif-strand inisye pa lye fòm UMPylated nsp9 nan ke poly(A) (deklanche), ki ka ankouraje pa lyezon RNA li Aktivite ak/oswa entèraksyon ak yon lòt pwoteyin RTC.Lè sa a, pòsyon UMP bay nan nsp9 ka itilize kòm yon "primer" pou nsp7/8/nsp12-medyatè oligouridylation, lè l sèvi avèk ke 3??²-poly(A) nan RNA jenomik la oswa yon lòt sekans oligo (A) ki gen ladann. sèvi kòm yon modèl, menm jan ak mekanis ki etabli pou pwoteyin nan VPg picornavirus (44).E si pwopozisyon an se "ki pa nòmal"????Inisyasyon nan sentèz RNA negatif (pwoteyin pwovoke) bay yon lyen nan obsèvasyon yo, ki endike ke RNA negatif sou kowonaviris la gen UMP (olye pou yo UTP) nan fen li (42), ki konsidere kòm ki endike ke asid nikleyik Dicer fende fen fosforilation pa yon endonukleaz uridin espesifik.Si yo konfime, aktivite idrolitik asid nikleyik sa a ka ede lage fòm oligomerik UMPylated nsp9 ki soti nan fen 5 ² nan fil negatif ki nase.Wòl posib nsp9 nan priming pwoteyin yo konsistan tou ak etid jenetik ranvèse anvan yo, ki te montre ke nsp9 (ak nsp8) kominike yon fason kritik epi espesyalman ak eleman RNA ki konsève cis-aji toupre fen 3 nan genòm coronavirus la.45).Dapre rapò sa a, obsèvasyon anvan sa yo kapab kounye a dwe re-egzamine ak elaji atravè plis rechèch.

An rezime, done nou yo te detèmine aktivite espesifik yon tag anzim viris ki gen nibrike propriétaires ki lye ak RdRp nan N-tèminal la.Nan kowonaviris, aktivite UMPylator/NMPylator ki fèk dekouvri ak NiRAN yo itilize pou konte sou Mn2+ ak rezidi Asn adjasan yo epi lakòz fòmasyon lyezon fosforamidat (ki ba-enèji) ak amine prensipal N-tèminal la.Atravè klivaj Mpro-medyatè nan sit la klivaj nsp8 | 9, sib la nsp9 ka itilize pou NMPylation, ki endike kouple a fonksyonèl ant proteaz la ak domèn nan NiRAN, ki pwolonje nan RdRp.Konsèvasyon résidus kle nan sit aktif nsp12 NiRAN ak sib nsp9 la, ansanm ak done yo jwenn nan de coronavirus ki gen ladan SARS-CoV-2, bay prèv solid ke nsp9 NMPylation se yon coronavirus Karakteristik konsèvatif yo tou se yon etap kle nan replikasyon viris.Done ki disponib yo mennen nou konkli ke wòl espesifik fòm NMPylated nsp9 nan sentèz RNA pwovoke pwoteyin se yon senaryo rezonab pou kowonaviris ak lòt viris enbrike, epi NiRAN ka vize tou lòt pwoteyin ki pa idantifye.Regle viris la.Entèaksyon lame.Si yo konfime, patisipasyon primè pwoteyin nan sentèz RNA viral ap ogmante afinite sekans domèn Mpro/3CLpro ak RdRp ant kowonaviris yo te detekte deja ak sipègwoup ki sanble ak pikornaviris (9), ki kounye a inifye nan Pisonivirites ki fèk etabli yo (9). 46) nan kategori a.

Done nou yo montre tou ke aktivite anzim debaz, selektif ak konsèvatif yo idantifye nan etid sa a ka itilize kòm sib pou dwòg antiviral.Konpoze ki entèfere ak obligatwa (ak modifikasyon ki vin apre) nan nsp9 N-tèminal konsève nan sit aktif NiRAN yo ka devlope nan dwòg antiviral efikas ak versatile, apwopriye pou tretman kowonaviris bèt ak imen ki soti nan diferan (sub)genus Enfeksyon. , ki gen ladan SARS-CoV-2 ak Coronavirus Sendwòm Respiratwa Mwayen Oryan.

RT-PCR itilize RNA ki izole nan Huh-7 ki enfekte ak HCoV-229E oswa Vero E6 ki enfekte ak SARS-CoV-2, epi mete yo lè l sèvi avèk pwosedi klonaj estanda yo te anplifye sekans kodaj pwoteyin coronavirus ki te pwodwi nan etid sa a.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) oswa pASK3-Ub-CHis6 (47) vektè ekspresyon (SI Apendis, Tablo S1 ak S2).Ranplasman kodon sèl yo te entwodwi pa mutagenèz ki baze sou sit ki baze sou PCR (48).Pou pwodwi pwoteyin fizyon MBP, selil E. coli TB1 yo te transfòme ak konstriksyon plasmid pMAL-c2 ki apwopriye a (SI apendis, Tablo S1).Pwoteyin fizyon an te pirifye pa chromatografi afinite amiloz ak fennen ak faktè Xa.Imedyatman, C-terminal His6-tagged pwoteyin lan te pirifye pa Ni-imobilize metal afinite chromatography (Ni-IMAC) jan yo dekri deja (49).Pou pwodwi pwoteyin fizyon ubiquitin la, selil E. coli TB1 yo te itilize konstriksyon plasmid pASK3-Ub-CHis6 apwopriye (SI Apendis, Tablo S1 ak S2) ak ADN plasmid pCGI ki kode ubiquitin-espesifik C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Transfòmasyon (47).Pwoteyin kowonaviris ki make C-terminal His6 la te pirifye jan sa te dekri deja (50).

Tès pwòp tèt ou-NMPylation nan HCoV-229E nsp12-His6 te fèt jan sa dekri nan EAV nsp9 (16).Nan ti bout tan, nsp12-His6 (0.5 µM) gen 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM tanpon, enkubasyon. NTP espesifye a ak 0.17 µM matche [α32-P] NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) nan 30 °C pou 30 minit.Nan tout lòt (estanda) tès NMPylation nsp12-medyatè nsp9 NMPylation, kondisyon reyaksyon yo ajiste jan sa a: nsp12-His6 (0.05 µM) ak nsp9-His6 (4 µM) nan prezans 50 mM HEPES-KOH (pH 80). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM endike NTP, ak 0.17 µM matche [α32-P] NTP.Apre enkubasyon pou 10 minit nan 30 ° C, echantiyon reyaksyon an te melanje ak tanpon echantiyon SDS-PAGE: 62.5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% gliserin ak 0.005% bromofenol. ble.Pwoteyin la te denatire lè yo chofe nan 90 °C pou 5 minit epi separe pa 12% SDS-PAGE.Se jèl la fiks ak tache ak solisyon Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% asid acetic, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), dekolorize, epi ekspoze a yon ekran imaj fosforesan pou 20 èdtan (pou detekte nsp12 soti nan NMPylation) oswa (maksimòm) 2 èdtan (pou evalye nsp9 NMPylation).Yo te itilize yon imager Typhoon 9200 (GE Healthcare) pou eskane ekran an epi yo te itilize ImageJ pou analize entansite siyal la.

Pou analiz MS, yo te itilize 1 µM nsp12-His6 ak 10 µM nsp9 (san tag hexahistidine) nan analiz NMPylation (SI apendis, Tablo S1) epi yo te itilize konsantrasyon ogmante nan 500 µM UTP ak GTP.Tou depan de konsantrasyon yo ak bon jan kalite pwoteyin yo espere, yo te itilize yon sistèm HPLC Waters ACQUITY H-Class ekipe ak yon kolòn MassPrep (Waters) pou desal 1 a 10 µL solisyon pwoteyin tampon sou entènèt.Pwoteyin desalated la eliye nan sous iyon electrospray Synapt G2Si mas spectrometer (Waters) atravè gradyan sa a nan tanpon A (dlo/0.05% asid fòmik) ak tanpon B (acetonitrile/0.045% asid fòmik), ak tanperati kolòn lan se 60 ° C ak yon pousantaj koule nan 0.1 mL / min: elisyon izokratik ak 5% A pou 2 minit, Lè sa a, yon gradyan lineyè a 95% B nan 8 minit, epi kenbe 95% B pou yon lòt 4 minit.

Yo detekte iyon pozitif ak yon seri mas de 500 a 5000 m/z.Glu-fibrinopeptide B mezire chak 45 segonn pou koreksyon otomatik derive mas.Sèvi ak lojisyèl enstriman MassLynx ak ekstansyon MaxEnt1 pou dekonvoke spectre an mwayèn apre yo fin dedwi debaz la ak atenuasyon.

UMPylated HCoV-229E nsp9 te dijere pa ajoute sekans-klas modifye tripsin (Serva) ak enkubasyon lannwit lan nan 37 °C.Yo te itilize yon kolòn vire Chromabond C18WP (nimewo pati 730522; Macherey-Nagel) pou desal ak konsantre peptides yo.Finalman, peptide a te fonn nan 25 µL dlo, ki te genyen 5% asetonitrile ak 0.1% asid fòmik.

MS te analize echantiyon yo lè l sèvi avèk yon espektwomèt mas Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Ultim nanoâ HPLC sistèm (Dionex), ekipe ak yon koutim fen-monte 50 cm??75 μm C18 RP kolòn chaje ak 2.4 μm pèl mayetik (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Konekte ak espektwomèt mas la sou entènèt atravè sous la nanospray Proxeon;enjekte 6 µL solisyon dijesyon tripsin nan yon dyamèt enteryè 300 µm ×??1 cm C18 PepMap kolòn pre-konsantrasyon (Thermo Scientific).Sèvi ak dlo / 0.05% asid fòmik kòm sòlvan an, echantiyon an te otomatikman bloke ak desalinated nan yon pousantaj koule nan 6 µL / min.

Gradyan sa yo nan dlo / 0.05% asid fòmik (sòlvan A) ak 80% acetonitrile / 0.045% asid fòmik (sòlvan B) yo te itilize pou reyalize separasyon nan peptides tryptic nan yon pousantaj koule nan 300 nL / min: 4% B pou 5 minit, Lè sa a, 30 A lineyè gradyan a 45% B nan minit, ak yon ogmantasyon lineyè a 95% sòlvan B nan 5 minit.Konekte kolòn chromatografik la nan yon nano-emetteur asye pur (Proxeon), epi flite eluyan an dirèkteman nan kapilè chofe nan espektromèt mas la lè l sèvi avèk yon potansyèl de 2,300 V. Eskanè sondaj la ak yon rezolisyon 60,000 nan analizè mas Orbitrap la asosye. ak omwen twa done MS / MS eskanè, dinamik eskli pou 30 segonn, lè l sèvi avèk lineyè iyon pèlen kolizyon pwovoke disosyasyon oswa pi wo enèji kolizyon disosyasyon konbine avèk deteksyon orbitrap, rezolisyon an se 7,500.